La trama di Eyeshield 21 ruota attorno a un ragazzo umile e dal fisico minuto di nome Sena Kobayakawa che si iscrive alla scuola superiore Deimon Private Senior High School, frequentata dalla sua amica d'infanzia Mamori Anezaki , più grande di un anno. Le uniche caratteristiche fisiche degne di nota sono la velocità di corsa e l'abilità di schivare gli ostacoli, che catturano l'attenzione del capitano della squadra di football Americano della scuola Yoichi Hiruma che obbliga Sena ad unirsi al team dei Deimon Devil Bats nel ruolo di running back.Per proteggere la sua identità (sulla base del criterio che gli altri club sportivi della scuola potrebbero tentare di reclutare Sena una volta scoperte le sue doti atletiche) Sena è obbligato ad assumere formalmente il ruolo di scout (amministratore) della squadra, e ad entrare in campo indossando un casco dotato di una visiera (eyeshield in inglese) di colore verde per nascondere il volto e la sua identità sotto lo pseudonimo di "Eyeshield 21." Una formazione improvvisata partecipa inizialmente al torneo di football di Primavera (che si svolge all'inizio dell'anno scolastico giapponese) sperando di vincere le partite grazie alla forza della loro nuova "arma segreta". Ma la squadra, molto debole, è presto eliminata dagli Ojo White Knights, una squadra molto quotata. Molti pensano che il talento degli attuali White Knights sia inferiore rispetto a quello della precedente "Generazione d'Oro", ma i membri della squadra stanno tentando di dimostrare che posseggono tutte le qualità per surclassare i loro predecessori. È durante questa partita che Sena incontra il ragazzo che riconoscerà essere il suo rivale finale, Seijuro Shin, un linebacker di talento.Dopo la sconfitta dei Deimon, il torneo di Primavera si rivela essere di secondaria importanza rispetto al torneo d'Autunno, dove le squadre lottano per conquistare la possibilità di giocare il "Christmas Bowl", la partita che assegna la vittoria nella lega di football delle scuole superiori. Hiruma, Kurita e Sena raggruppano e costruiscono lentamente una vera squadra raggruppando altri disadattati e studenti in cerca di stimoli, con l'obiettivo di diventare i campioni. La serie segue la costruzione e i miglioramenti dei Deimon Devil Bats e dei suoi componenti, oltre che le amichevoli e i tornei contro svariati avversari, il tutto fatto allo scopo di raggiungere il sogno di giocare nel Christmas Bowl.
